Главная / Публикации (Журнал «КТ») /
« 03.06.2004

Идея клеточной трансплантации для лечения ишемии нижних конечностей (ИНК) (прежде всего атеросклеротического и диабетического генеза) успешно реализуется последние 5 лет - в эксперименте и 2 года - в клинике. Это стало возможным, в связи с интенсивным изучением клеточных механизмов ангиогенеза и выделением клеток-предшественников сосудистого эндотелия и ангиобластов.

В эксперименте, на модели локальной ишемии конечности (лигирование ветвей бедренной артерии), было предложено использовать различные клетки-кандидаты для неоангиогенеза в ишемизированой зоне - мононуклеары костного мозга [1] и периферической крови [3], тромбоциты периферической крови совместно с мононуклеарами [3], эндотелиальные прогениторные клетки, мобилизированные в периферический кровоток [4], гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) (CD34+ [5] и CD133+ [6]) эндотелиальные прогениторы [8] пуповинной крови человека, стромальные клетки костного мозга [7] и "костномозговые фибробласты" [1] после культивирования. Был показан ангиогенетический эффект мононуклеарных клеток костного мозга и на модели периферической диабетической ангиопатии [9]. Почти во всех исследованиях производилась множественная внутримышечная трансплантация клеток. Однако, недавно было показано, что однократное внутриартериальное введение клеток по эффективности сравнимо с внутримышечной трансплантацией [10].

Богатая экспериментальная база позволила перейти к клиническим испытаниям метода. Всего было опубликовано 7 клинических исследований, подробнее остановимся лишь на самых значительных.

В 2002 году появилось пилотное исследование, опубликованное в Lancet.

Это исследование [12] отличается и своей масштабностью. Все пациенты были поделены на 2 группы: первая - с унилатеральной ишемией (n=25), получала трансплантацию мононуклеарных клеток костного мозга - с одной стороны и физ. раствора - с другой (контроль 1), вторая - билатеральная ишемия (n=22), получала трансплантацию мононуклеарных клеток костного мозга - с одной стороны и периферической крови (без цитокиновой мобилизации - контроль 2) - с другой. Аутологичные клетки выделяли из аспиратов костного мозга (объём 500 мл.) и через 3 часа вводили в ишемизированные мышцы (общий объём суспензии 30 мл. х 40 инъекций). Среднее количество вводимых клеток - 1-2 миллиарда. Время динамического наблюдения - 24 недели после трансплантации. 2 пациента в группе 1 - умерли от инфаркта миокарда в течение 2 лет (1 до трансплантации, второй через 3.2 мес. - после, и были исключены из наблюдения), а 2 пациента из группы 2 отметили ухудшение состояния до 4 нед. после трансплантации. Основные критерии терапии - перфузионный индекс, чрезкожное давление кислорода и боли в покое. Инструментальные показатели улучшились в той или иной степени у всех пациентов, получавших трансплантацию клеток костного мозга, в отличие от "контрольных конечностей", где сохранялись исходные цифры. Боли в покое уменьшились у 80% после трансплантации клеток костного мозга и остались у 85% после трансплантации клеток крови. Ангиографически отмечали развитие коллатерального кровообращения в 27 конечностях из 45 после трансплантации клеток костного мозга. Эти результаты сохранялись и при длительном наблюдении в течение 24 недель. В биопсийном материале умершего от инфаркта пациента было вывлено, что введённые клетки активно пролиферируют (по маркёру Ki-67) и образуют новые сосуды и эндотелий (по маркёру CD-31), чего не наблюдалось на контрольной стороне [12]. Аналогичное (по методике) исследование было опубликовано и в Cell Transplantation - группой Esato K, но выполненное уже на пациентах (n=8) с хроническими заболеваниями периферических артерий, сопровождающимися трофическими расстройствами в виде язв [16].

Недавно было описано клиническое наблюдение эффективного лечения 78-летнего пациента с тяжёлым облитерирующим атеросклерозом, сопровождающимся полной окклюзией артерий голени. Аутологичная трансплантация мононуклеаров костного мозга привела к мощному развитию коллатерального кровообращения (наблюдение через месяц), что позволило избежать ампутации конечности [18].

Более детальное изучение возможного механизма действия клеток, изложено в работе японцев, опубликованной в Circulation [13]. Ими изучалась функция эндотелия под влиянием клеточной трансплантации у больных с ИНК. Дисфункция эндотелия является основным звеном патогенеза (возникновения и проресса) системного атеросклероза - вообще и локальных ишемий - в частности.

В исследование было включено 7 человек с болями в ногах в покое и незаживающими язвами. При отборе исключались пациенты с сахарным диабетом, злокчественными новообразованиями и ИБС. Костный мозг забирали из костей таза в обёме около 500 мл., затем аппаратно выделяли из него мононуклеарную фракцию. Клетки вводили непосредственно в бедренные артерии через катетер. Среднее количество клеток - 1.6 миллиардов, из них CD34(+)-клеток было только ~ 2.5% (~ 38 миллионов). Изучалось влияние клеточной трансплантации на функцию эндотелия и кровоток в ишемизированной области. Кровоток измеряли ангиографически на фоне приема ацетилхолина (в качестве эндотелий-зависимого вазодилататора) и нитропруссида натрия (эндотелий-независимый вазодилататор) до и после введения клеток.

Трансплантация клеток улучшала различные показатели кровотока в ишемизированной конечности, удлиняла время безболевого периода при ходьбе, способствовала ускорению заживления язв. Кровоток усилился после трансплантации клеток на фоне ацетилхолина, но не изменился на фоне нитропруссида натрия.

Таким образом, улучшение кровотока в ишемизированной конечности при трансплантации аутологичных мононуклеарных клеток костного мозга, объясняется усилением эндотелий-зависимой вазодилатации.

Мононуклеары периферической крови - следующий наиболее часто применяемый клеточный материал для терапии ишемии нижних конечностей. Группа группой Ikeda U [17] провела сравнительное исследование эффективности трансплантации мононуклеарной фракции костного мозга и периферической крови (без цитокиновой мобилизации) на 5 пациентах с заболеваниями периферических артерий. Оказалось, что клетки крови по эффективности могут быть сравнимы с костным мозгом. Казалось бы, эти данные идут вразрез с результатами пилотного исследования [12]. Но в данном случае исследователи добивались секреции фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) после суточной инкубации клеток крови и производили совместную трансплантацию 2-х видов клеток. Уровень этого фактора повышался в сыворотке крови после такой "двойной" трансплантации, чего не наблюдалось после введения мононуклеарных клеток только костного мозга [17].

Китайские исследовали предприняли попытку аутологичной трансплантации ГСК, методом мобилизации их из костного мозга в переферическую кровь [14].

Теоретической предпосылкой явилось недавнее исследование на кроликах [11], где была показана возможность реэндотелизации повреждённых сосудов методом мобилизации эндотелиальных прогениторов введением рекомбинантного гранулоцитарно-макрофагального колоние-стимулирующего фактора [11].

Итак, в "китайском исследовании" приняли участие 5 человек, страдающих облитерирующим атеросклерозом нижних конечностей III и IV степени (хронической ишемии) и получавших до этого стандартную терапию (включая урокиназу и простагландин Е1). Все пациенты имели трофические кожные нарушения в виде язв и начинающейся гангрены пальцев стоп.

Для мобилизации ГСК применяли гранулоцитарный колоние-стимулирующий фактор (Г-КСФ) по 5-ти дневной схеме. На 5-е сутки забирали кровь и выделли мононуклеарную фракцию, обогащённую CD34+ клетками (0.12%). Цитокиновая мобилизация позволила увеличить количество CD34+ клеток в "периферии" в среднем в 100 раз. Клетки вводили в ишемизированные мышцы ~ 30 инъекциями на глубину 1-1.5 см. через 3 часа после выделения. Инъекции повторяли через 40 дней.

Время динамического наблюдения за пациентами - 12 нед. после процедуры. Наблюдалось уменьшение или исчезновение боли, повышение кожной температуры, стимуляция заживления язв и постепенное исчезновение гангрены пальцев. Инструментально было показано улучшение показателей перфузии конечностей - кровоток по допплеру, перфузионный индекс и давление кислорода. Не было выявлено объективных признаков улучшения кровотока только у 1 пациента, из-за имеющейся гангрены. Причём этот эффект (по инструментальным показателям) сохранялся и спустя 3 месяца после трансплантации. Побочных эффектов и осложнений не наблюдалось [14].

Аналогичное, но более раннее (пилотное по методике) исследование было выполнено японскими авторами на 2 пациентах в прошлом году [19]. Результаты - аналогичные. Общее количество вводимых CD34+ клеток (после мобилизации) составило ~ 100 000 и 160 000.

В последнем исследовании показана так же эффективность аутотрансплантации клеток костного мозга у 6 пациентов с болезнью Бюргера [15].

Некоторые данные по клеточной аутотрансплантации при ИНК в клинике.

исследование	n =	Патология	Вид клеток	Результаты
Tateishi-Yuyama E, et al. 2002 [12]	43	Атеросклероз	Мононуклеары КМ	Уменьшение болей в покое (80%), развитие коллатерального кровообращения (ангиографически) – 60%, улучшение индекса перфузии и давление кислорода в 1.5-2р. – 100%, заживление язв, усиление болей (ухудшение) – n=2
Esato K, et al. 2002 [16]	8	хр. заболевания периферических артерий	Мононуклеары КМ	Субъективное улучшение 7 из 8, закрытие язв 2 из 3
Matsui K, et al. 2003 [17]	5	хр. заболевания периферических артерий	Мононуклеары КМ и ПК	Улучшение индекса перфузии и давление кислорода – у всех
Kudo FA, et al. 2003 [19]	2	Атеросклероз, диабетическая стопа (ангиопатия)	Мононуклеары ПК, обогащённые фракцией CD34+ клеток после цитокиновой мобилизации	Уменьшение болевого синдрома, улучшение индекса перфузии, давление кислорода – без динамики, ангиография – развитие коллатералей
Higashi Y, et al. 2004 [13]	7	хр. заболевания периферических артерий	Мононуклеары КМ	Увеличение времени ходьбы без боли, улучшение индекса перфузии и давления кислорода, ангиографических показателей
Huang PP, et al. 2004 [14]	5	Атеросклероз	Мононуклеары ПК, обогащённые фракцией CD34+ клеток после цитокиновой мобилизации	уменьшение или исчезновение болей – у всех, улучшение показателей - кровоток по допплеру, перфузионный индекс и давление кислорода – у 4 из 5.
Teiji O. 2004 [15]	8	Атеросклероз, болезнь Бюргера	Мононуклеары КМ	Быстрое заживление язв на 4 из 9 конечностях, улучшение ангиографических показателей в 7 конечностях из 9

Сокращения: КМ - костный мозг, ПК - периферическая кровь

Таким образом, за последние 2 года были получены первые клинические данные, демонстрирующие безопасность и эффективность метода клеточной трансплантации для лечения больных с ИНК. Эти данные позволяют продолжить исследования в этом направлении. Но переходить к более масштабным клиническим испытаниям ещё рано. Хотя и выработана оптимальная и универсальная схема внутримышечной трансплантации клеток (в 6 исследованиях из 7), но не решён вопрос об оптимальном виде клеточного материала.

Думаю, что более эффективна была бы трансплантация эндотелиальных прогениторных клеток (EPC) (источником которых может быть костный мозг, периферическая кровь после цитокиновой мобилизации и пуповинная кровь) в сочетании с применением ангиогенных факторов роста (например VEGF). Стоит попробовать и сочетанную методику введения клеток - внутриартериально (в бедренную артерию и/или её ветви), внутримышечно и местно (на язвенный дефект).
 

Литература:

эксперимент:
1. Shintani S, et al. Augmentation of postnatal neovascularization with autologous bone marrow transplantation. Circ 2001; 103: 897–895
2. Ikenaga S, et al. Autologous bone marrow implantation induced angiogenesis and improved deteriorated exercise capacity in a rat ischemic hindlimb model. J Surg Res 2001; 96: 277-283
3. Iba O, et al. Angiogenesis is by implantation of peripheral blood mononuclear cells and platelets into ischemic limbs. Circ 2002; 106: 2019-2025
4. Asahara, T, et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J 1999; 18: 3964-3972
5. Pesce M, et al. Myoendothelial differentiation of human umbilical cord blood–derived stem cells in ischemic limb tissues. Circ Res 2003; 93: e51
6. Yang C, et al. Transplantation of cord blood endothelial progenitor cells ameliorates limb ischemia. Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2003; 83; 16: 1437-1441
7. Al-Khaldi A, et al. Therapeutic angiogenesis using autologous bone marrow stromal cells: improved blood flow in a chronic limb ischemia model. Ann Thorac Surg 2003;75; 1: 204-209
8. Murohara T, et al. Transplanted cord blood–derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization. J Clin Invest 2000; 105: 1527–1536
9. Hirata K, et al. Autologous bone marrow cell implantation as therapeutic angiogenesis for ischemic hindlimb in diabetic rat model. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2003; 284; 1: H66-70
10. Yoshida M, Intra-arterial bone marrow cell transplantation induces angiogenesis in rat hindlimb ischemia. Eur Surg Res 2003; 35: 86-91
11. Cho H-J, et al. Mobilized endothelial progenitor cells by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor accelerate reendothelialization and reduce vascular inflammation after intravascular radiation. Circ 2003;108: 2918


клиника:
12. Tateishi-Yuyama E, Matsubara H, Murohara T, et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomized controlled trial. Lancet 2002; 360: 427–435
13. Higashi Y, et al. Autologous bone-marrow mononuclear cell implantation improves endothelium-dependent vasodilation in patients with limb ischemia. Circ 2004; 109: 1215-1218
14. Huang PP, et al. Autologous transplantation of peripheral blood stem cells as an effective therapeutic approach for severe arteriosclerosis obliterans of lower extremities. Thromb Haemost 2004; 91: 606-609
15. Teiji O. Treatment for limb ulcer with severe ischemia: therapeutic angiogenesis by autologous transplantation of bone-marrow. Wound Repair Regen. 2004; 12; 1: A5 (abstract)
16. Esato K et al. Neovascularization induced by autologous bone marrow cell implantation in peripheral arterial disease. Cell Transplant 2002; 11; 8: 747-752
17. Matsui K, et al. Therapeutic angiogenesis by transplantation of autologous bone marrow and peripheral blood mononuclear cells in patients with peripheral arterial disease. Int J Angiol 2003; 12; 3: 155-161
18. Hasebe H, et al. Therapeutic angiogenesis by autologous transplantation of bone-marrow cells in a patient with progressive limb ischemia due to arteriosclerosis obliterans: a case report. J Cardiol 2004; 43; 4: 179-183
19. Kudo FA, et al. Autologous transplantation of peripheral blood endothelial progenitor cells (CD34+) for therapeutic angiogenesis in patients with critical limb ischemia. Int Angiol 2003; 22; 344-348
20. Matsubara H. Therapeutic angiogenesis for patients with critical limb ischemia using autologous bone marrow cell transplantation. Nippon Naika Gakkai Zasshi (japan) 2003; 10; 92; 5: 877-883

Эндотелиальные прогениторные клетки костного мозга кролика в культуре.
(Circ 2001; 103: 899)
 
 

Заживление трофической язвы большого пальца через 8 недель после (справа) аутологичной трансплантации клеток костного мозга.
 
 

Ангиографические данные через 24 недели после ( справа) трансплантации клеток костного мозга.
 
 

CD31+ клетки (коричнева окраска) в структуре микрососудов скелетных мышц через 3.2 мес. после трансплантации клеток костного мозга (слева), в отличие от контроля (физ. раствор - справа).
(1-4 from Lancet 2002; 360: 427–435)